Rajades 2 ja 3 täheldatud ribad, mis on veidi alla bp, näitavad nukleosomaalse DNA olemasolu rakkudes, mis loovad järjestuse korral mittespetsiifilise tausta; tähele, et reas 1 puudub nukleosomaalne DNA FACS sorteeritud. Vastasel juhul on scDNase-seq protseduuri etapid sarnased tavalise DNase-seq-ga. Kõige olulisem paranemine tuleneb algrakkude arvu suurendamisest —1 rakkude vahemikku. Raamatukogu suuruse valik. Pärast oma lemmikkujundustoote kreemi, geeli või vahuna kasutamist saate sellel kuivada.
Transkriptomika Abstraktne Suurenenud kromatiini kättesaadavus on rakutüüpi spetsiifiliste cis- regulatoorsete elementide tunnusjoon; seetõttu võimaldab DNaasi I ülitundlike saitide DHS kaardistamine tuvastada transkriptsiooni aktiivseid regulatoorseid elemente, kaasa arvatud promootorid, võimendid, isolaatorid ja lookus-kontroll piirkonnad.
See meetod võimaldab ülitundlike saitide genoomilist kaardistamist paljudes rakupopulatsioonides, mida ei saa analüüsida tavapärase DNaasi I sekveneerimise abil, kuna on vaja miljoneid lähterakke.
EUR-Lex - R - ET - EUR-Lex
ScDNase-seq analüüsideks sobivad värsked rakud, formaldehüüdi-ristseotud rakud või formaliinist fikseeritud parafiiniga varustatud FFPE koeslaidid.
ScDNase-seq-raamatukogude genereerimiseks lüüsitakse rakud ja seejärel digereeritakse DNaasiga. Raamatukogud luuakse Illumina platvormil suure läbilaskevõimega järjestamiseks standardmeetodite Surmina Step Gel. ScDNase-seq raamatukogude ettevalmistamine nõuab ainult 2 d. Käesolevas protokollis kirjeldatud materjalide ja molekulaarbioloogia meetodid peaksid olema ligipääsetavad kõigile üldistele molekulaarbioloogia laboritele. Suure läbilaskevõimega järjestusandmete töötlemine nõuab põhilisi bioinformaatika oskusi ja kasutab Surmina Step Gel kättesaadavat bioinformaatika tarkvara.
Sissejuhatus Genoomi koordinaat-raku-tüüpi spetsiifilise geeniekspressiooni regulatiivsed DNA piirkonnad 1. Nendes piirkondades võib nukleosoome dünaamiliselt eemaldada või lisada, et kontrollida kromatiini siduvate valkude ligipääsu DNA-le transkriptsiooni ja teiste tuumaprotsesside ajal. Suurenenud kromatiini kättesaadavusega genoomilised piirkonnad on markerid mitmesuguste regulatiivsete tunnuste jaoks, kaasa arvatud võimendajad, summutid, promootorid, lookus-kontroll piirkonnad ja isolaatorid.
Seega annab kromatiini kättesaadavuse mõõtmise vahend regulatiivsete DNA elementide tuvastamiseks. DNaasi sekveneerimine DNaas-seq ja ülekandega ligipääsetava kromatiini määramine suure läbilaskevõimega sekveneerimisega ATAC-seq on kõige levinumad meetodid DNA juurdepääsetavuse tuvastamiseks genoomiga hõlmatud skaalal 2, 3, 4, 5.
Selles protokollis kirjeldame üheelemendilist sekveneerimist scDNase-seq - modifitseeritud DNase-seq protokolli üheelemendilise või piiratud rakuga sisenditele 6.
Üheelemendilisel tasemel võib scDNase-seq korrata tuvastatavaid samu DHS-e lahtiselt elanikkonnast, võimaldades samal ajal uurida rakkude ja rakkude vahelisi erinevusi populatsioonis. Tavapäraste DNaasi-seq-de piiramine rakkude hulgal on see, et ta ei suuda tuvastada rakkude ja rakkude variatsioone DHS-ides. DHSide erinevused üksikute rakkude vahel näiliselt "homogeenses" rakupopulatsioonis võivad olla bioloogiliselt olulised 7.
ScDNase-seq pakub meetodit rakkude ja rakkude vahelise varieeruvuse tuvastamiseks DHS-des rakkude hulgapopulatsioonis. ScDNase-seq arendamine ja ülevaade Algne DNase-seq meetod nõuab miljoneid rakke ja seetõttu on selle rakendamine piiratud rakuliinidega või rohkete primaarsete rakutüüpidega 3.
ScDNase-seq meetod kohandab DNase-seqi kasutamiseks üksikute rakkude või piiratud rakkudega, kaasates bakteriaalse ringikujulise kandja DNA-d, et minimeerida proovi DNA kadu töötlemise ajal. Täiendavad muudatused tavapäraste DNaasi seq-de hulka hõlmavad tuumade isoleerimise, DNase-I digereerimisetappide optimeerimist piiratud rakkude arvu korral ja DNA fragmentide fraktsioneerimise Surmina Step Gel agaroosgeeliga, et minimeerida DNA kadu, samuti PCR-i tingimuste optimeerimist kuni eelistatult amplifitseerivad soovitud väikesed DNA fragmendid.
Vastasel juhul on scDNase-seq protseduuri etapid sarnased tavalise DNase-seq-ga. Esiteks, raku- ja tuumamembraanid permeabiliseeritakse nii, et DNaasi I ensüüm võib siseneda tuuma. Genoomsed piirkonnad, mis ei ole seotud histoonide, transkriptsioonifaktorite või muude regulatiivsete valkudega, on DNaasi I ensüümile suhteliselt paremini kättesaadavad. Lõhustatud DNA puhastatakse, valmistatakse järgmise põlvkonna sekveneerimisraamatukogud ja väikseimad DNA fragmendid sekveneeritakse suure läbilaskvusega sekveneerimise teel.
Samuti on võrreldav andmete töötlemine scDNase-seq-s ja tavapärases DNase-seq-s.
Lühikesed lugemid, mis on genereeritud suure läbilaskvusega järjestuse abil, on joondatud sobiva genoomi Kuunarnuki liinide poldid ja identifitseeritakse unikaalsed mittetundlikud loendid. Mitme lugemise kogumine konkreetses genoomilises asukohas näitab DHSi piigi olemasolu ja seda saab identifitseerida olemasoleva piigi kutsuva tarkvaraga.
Siiski ei ole maksimaalne kõne, kui alustatakse vähem kui kümnest lahtrist, kuna igas DHSis on piiratud arv lugemisi. Analüüsiprotsessi vajalikke modifikatsioone scDNase-seq protseduuris käsitletakse üksikasjalikumalt eksperimentaalse disaini osas. Võrdlus teiste meetoditega Algne ATAC-seq meetod on optimeeritud täpselt 50 raku jaoks, et tagada Surmina Step Gel DNA õige suhe transposaasiga, mis märgistab ligipääsetavaid piirkondi. ATAC-seq tundlikkus ja spetsiifilisus langevad märkimisväärselt või rakuga 2 alustamisel.
Kaubanduslikult saadava transtaasi kasutamine ATAC-seq jaoks suurendab proovi maksumust võrreldes scDNase-seq-ga, kuigi nüüd on võimalik iseseisvalt toota ensüümi 8.
Nendes protokollides eraldatakse üksikud rakud scATAC-seq jaoks kas programmeeritava mikrofluidika platvormi Fluidigm või tuumade kombineeriva indekseerimise abil. Nende lähenemisviiside eeliseks on see, et nad võimaldavad suuremat läbilaskevõimet tõhusalt testida suuremat arvu üksikuid rakke kui scDNase-seq. Samas on scatAC-seq kasutamiseks kohustuslik kasutada mikrofluidika masina kogemust, mistõttu on see tehniliselt keerulisem lähenemine võrreldes scDNase-seq-ga.
Seevastu scATAC-seq-i kvaliteedifiltreid läbivatel üksikutel rakkudel on, unikaalset lugemist. Seetõttu haarab scATAC-seq ainult väikese osa DHS-idest üksiku raku jaoks, mistõttu on vaja ühendada sadade üksikute rakkude tulemused, et teha sisulisi järeldusi.
Abstraktne
ATAC-seq on formaldehüüdi fikseeritud rakkudel hiljuti kirjeldatud, Surmina Step Gel 50 lähterakku Reguleerivate elementide sekveneerimise FAIRE-seq formaldehüüdi abil eraldatud isoleerimine on veel üks DNA kättesaadavuse test ja see on tundlikum distaalsete reguleerivate elementide tuvastamiseks kui DNase-seq 12, Sarnaselt standardse DNase-seq protokolliga vajab FAIRE-seq 1 kuni 10 miljonit rakku, piirates seega selle rakendatavust rikkalike rakutüüpide suhtes.
Rakendused ScDNase-seq võimaldab genoomiga hõlmatud DHSide avastamist paljudes rakutüüpides ja kudedes ilma piiranguteta lähtematerjali rohkuse tõttu.
Meie rühm ja teised on kasutanud scDNase-seq-d, et kaardistada regulatiivsed piirkonnad embrüonaalsetes tüvirakkudes, hematopoeetilistes tüvirakkudes ja arenevates embrüotes 6, Me loodame, et meetod on laialdaselt rakendatav sellistes valdkondades nagu tüvirakkude bioloogia, areng ja vähi bioloogia 7, Piirangud Automaatika.
Seega ei ole see võimeline töötlema sadu või tuhandeid üksikuid rakke korraga, nagu on võimalik mikrofluidika meetodil. Järjestuse tõhusus. Kuigi raamatukogu komplekssus on scDNase-seq-ga võrreldes oluliselt suurem kui scATAC-seq-ga, on üksiku raku raamatukogude Surmina Step Gel kaardistatud unikaalsete, mittetundlike lugemite protsent madal.
Iga üksiku raku raamatukogu sekveneerimine nõuab suurel hulgal lugemist, mis suurendab sekveneerimise kulusid. Rakendatavust ja raamatukogu keerukust saab aga oluliselt parandada, suurendades rakkude arvu.
Panuse suurendamine kümnele rakule toob kaasa logiraamatute arvu suurenemise raamatukogu kohta. DNaasi I ensüümi varieeruvus. DNaasil I on suhteliselt kitsas optimaalne ensümaatiline vahemik, et saavutada korralikult seeditav DNA. Lisaks varieerub DNaasi I ensümaatiline aktiivsus partiist palju ja võib väheneda isegi siis, kui see on nõuetekohaselt salvestatud.
Suhteline kromatiini kättesaadavus varieerub ka rakutüübilt. Sel põhjusel on vaja teostada DNase I kontsentratsioonide tiitrimine uue rakutüübi kasutamisel või algrakkude arvu reguleerimisel. Eksperimentaalne disain DNaasi I ensüümi tiitrimine. Kromatiini ligipääsetavuse tuvastamine DNase-seq abil põhineb põhimõttel, et nukleosoomivabad genoomilised piirkonnad on nukleosoomidega seotud piirkondadega võrreldes ülitundlikud DNaasi I lagundamise suhtes.
Ideaalne katse tuvastaks seega ainult nukleosiidivabad genoomilised piirkonnad, mis on seotud regulatiivsete elementidega. Siiski, kui seedimise aste ei ole hästi kontrollitud, saab nukleosoomidega seotud piirkondi ka täielikult lagundada DNaasi I abil, mis viib suurenenud tausta ja vähenenud spetsiifilisuseni. Teisest küljest vähendab alamjälgimine tuvastatavate ülitundlike kohtade arvu.
Need kontsentratsioonid töötasid rea algusrakkude arvuga ja genereerisid andmed meie laboritest hiljutises scDNase-seq paberis 6. Võimaluse korral vähendab iga proovi puhul kahe kuni kolme ensüümi kontsentratsiooni kasutamine mõningaid muutusi DNaas I lagundamise efektiivsuses. Meetodi uute rakutüüpide kohandamisel võib osutuda vajalikuks ensüümi tiitrimise läbiviimine laiema hulga ensüümikontsentratsioonide suhtes, et tuvastada konkreetse rakutüübi jaoks optimaalsed kaks või kolm ensüümi kontsentratsiooni joonis 1.
Kõik proovid PCR-ga amplifitseeriti 15 tsükli jooksul. Ensüümi kontsentratsiooni suurendamine annab lühemaid fragmente.
Kuid optimaalset DNaasi I kontsentratsiooni ei saa määrata ainult geeli kujutisest. Täissuuruses pilt Esimene samm DNase I raamatukogu kvaliteedi hindamisel on vaadata pärast PCR-i amplifitseerimist genereeritud fragmentide vahemikku.
- Eemaldamise liigeste ravi
- Mida teha, kui ola uhine parem kasi
- Saastjaga sudameatakkiga
Enamik DNaasi I-ga lõigatud fragmentidest peaks olema vahemikus kuni bp. Siiski ei piisa ainult geelipiltidest DNase I raamatukogu kvaliteedi määramiseks.
Kuidas eemaldada lokkis juuste sõlmed - Vihjeid -
Igast ensüümi kontsentratsioonist saadakse seega väike arv järjestusi 0, 5—1 miljonitet ennustada iga kontsentratsiooni signaali-müra suhet. Joonestades genoomiga hõlmatud transkriptsiooni alguspunktide TSS-id ümbritsetud lugemismärgise tiheduse iga kontsentratsiooni jaoks, on võimalik kindlaks teha, milline kontsentratsioon tekitab kõrgeima suhtelise rikastumise joonis 2. Nagu siinkohal on näidatud katse DNaasi I tiitrimise katsetes, kogutakse DNaasi I kõrgematel kontsentratsioonidel raamatukogu ettevalmistamisel rohkem väikesi fragmente.
Kuid need täiendavad väikesed lugemid pärinevad mitte-DHS-idest, mida tõendab TSS-i rikastumise vähenemine kõrgemate ensüümi kontsentratsioonide juures.
Ensüümi kontsentratsiooni tiitrimise saamiseks lahjendati DNaasi I näidatud viisil. Täissuuruses pilt Rakkude arvu alustamine.
See on tingitud nii tehnilistest piirangutest, et avastatakse kõik rakud ühest rakust ja "homogeensete" rakupopulatsioonide bioloogiline varieeruvus. Kuna rakupopulatsioonid moodustavad kogu elanikkonna ligipääsetavuse keskmise, on tõenäolisem, et ansambli andmetest madalamate tippudega DHS-idel on ühe raku tasandil rohkem varieeruvust.
Vastupidi, kõrge ekspressiooniga geenide regulatoorsed elemendid on kõige paremini tuvastatud DHS-id ühe raku Surmina Step Gel. Piiratud rakkude arvuga alustamisel paraneb DHSide tuvastamise võime rakkude arvu suurenemisega.
Kõige olulisem paranemine tuleneb algrakkude arvu suurendamisest —1 rakkude Surmina Step Gel. Lisaks suureneb järjestuse efektiivsus rakuga, mitte rakuga, alguses. Kui raku allikaks on FFPE koe slaidid, on tavaliselt piisav rakkude eemaldamiseks 5 Madalamate liigeste artroos 5 mm suurusest piirkonnast, kuigi täpne rakkude arv ei ole määratud.
Individuaalsete üksikute rakkude arv, mida testida, et täielikult ära võtta kõik võimalikud DHS-id massikogusest, varieerub sõltuvalt lahtise elanikkonna põhiomadustest, mistõttu on keeruline luua universaalseid soovitusi DHS-i profiilide genereerimine huvipakkuvast hulgipopulatsioonist võib aidata hinnata DHS-ide koguarvu, mida võib avastada scDNase-seq abil. Suurema populatsiooni DHSide võrdlemine koondatud üksikrakkude omadega annab hinnangu selle kohta, kui hästi üksikute rakkude kogum kogub varieeruvuse ulatuse lahtiselt.